导读

Epichlo?内生真菌仅存在于禾草地上组织中，通过增加凋落物返田和根系分泌物而间接影响土壤生物学特性。据报道，Epichlo?内生真菌通过改变凋落物质量和微生物分解者来影响土壤特性，从而影响凋落物的分解速率。然而，内生真菌侵染的凋落物返田后，对涉及硝化和反硝化作用的功能基因的潜在影响尚未深入研究。我们分别在S0(凋落物第一次返田)、S1(凋落物第二次返田)、S2(凋落物第三次返田)和S3(凋落物第三次返田后天)分别收集了内生真菌Epichlo?festucaevar.Lolii侵染以及未被侵染的凋落物覆盖下的土壤样品。对土壤中的有机碳(OC)、总氮(TN)、总磷(TP)、铵态氮(AN)、硝态氮(NN)、土壤微生物生物量碳(MBC)和氮(MBN)、氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的硝化功能基因（amoA）、编码含铜离子的亚硝酸盐还原酶(NirK)和含细胞色素cd1的亚硝酸盐还原酶(NirS)的反硝化功能基因nirK和nirS以及编码氧化亚氮还原的反硝化功能基因nosZ进行了检测。我们发现，Epichlo?侵染的凋落物提高了从S1到S3时期的土壤性质(OC、TN、AN、NN)和微生物生物量C，增加了S2和S3时期的微生物生物量N，但降低了S1的土壤pH值和S2、S3的C-N比。在S1和S3时，Epichlo?侵染凋落物与未被侵染的凋落物返田后，土壤中AOB-amoA功能基因的绝对丰度，以及nirK功能基因群落中浮霉菌、甲基杆菌属、亚硝酸菌属、出芽菌属、地嗜皮菌属和中华根瘤菌的相对丰度均显著提高。而nirK功能基因S1和S3时的绝对丰度和S3时的多样性，nosZ功能基因S1至S3的绝对丰度和S1时的多样性，以及AOB-amoA功能基因中变形菌的相对丰度，在Epichlo?内生真菌侵染的凋落物土壤中明显低于没有内生真菌的凋落物土壤。土壤水分、TP、OC、AN和MBN的含量是微生物群落改变的最佳解释变量。我们的结果通过将Epichlo?内生真菌侵染的凋落物返田，对土壤硝化和反硝化基因的响应有了新的认识。

论文ID

原名：GeneanalysisrevealsthatleaflitterfromEpichlo?endophyte-infectedperennialryegrassaltersdiversityandabundanceofsoilmicrobesinvolvedinnitrificationanddenitrification

译名：基因分析表明，内生真菌侵染的多年生黑麦草凋落物改变了参与土壤硝化和反硝化作用的微生物的多样性和丰度

期刊：SoilBiologyandBiochemistry

IF：5.

发表时间：.01

通讯作者：李春杰

通讯作者单位：兰州大学草地农业科技学院

实验设计

结果

1土壤性质和OC、TN以及TP的比率内生真菌侵染的凋落物返田的次数显著提高了土壤pH值、土壤NN、OC和TN含量(图1a、c、d和e)，但显著降低了C-N比值(图1g)。在不同的凋落物返田次数(S1、S2和S3)下，EI(Epichlo?-侵染凋落物)返田土壤中AN、NN、OC和TN的含量显著高于EF(无Epichlo?内生真菌凋落物)返田土壤(图1b、c、d和e)。在凋落物第二次返田（S1）的情况下，EI土壤的pH值明显低于EF土壤(图1a)，但在凋落物第三次返田（S2）和凋落物第三次返田天（S3）的情况下，EI返田土壤的C-N比明显低于EF返田土壤(图1g)。凋落物返田次数和返田凋落物的状态对土壤TP含量有显著影响（图1f）。图1.凋落物返田次数(S0、S1、S2和S3)对pH值(a)、AN含量(b)、NN含量(c)、OC含量(d)、TN含量(e)、TP含量(f)、C-N(g)、C-P(h)和N-P(i)的影响。2微生物生物量碳和氮内生真菌侵染的凋落物返田次数显著增加了MBC和MBN，它们之间的相互作用也显著增加了微生物的生物量（图2）。在不同的凋落物返田次数(S1、S2和S3)下，EI返田土壤的MBC大于EF返田土壤(图2a)，S1和S3下MBN大于EF返田土壤(图2b)。图2.凋落物返田次数(S0、S1、S2和S3)对EI和EF土壤中微生物生物量碳(a)和微生物生物量氮的影响(b)。3硝化和反硝化功能基因的绝对和相对丰度除AOA-amoA和nirS功能基因的绝对丰度外，AOB-amoA、nirK和nosZ功能基因的绝对丰度均受植物是否被内生真菌侵染和凋落物返田次数的显著影响。在不同的凋落物返田次数下，EI返田土壤中AOB-amoA功能基因的绝对丰度大于EF返田土壤(S1和S3)(图3b)，而nirK功能基因的绝对丰度明显下降(S1和S3)(图3e)。在不同的返田时间下（S1、S2和S3），被Epichlo?内生真菌侵染的凋落物对nosZ功能基因的绝对丰度有负面影响（图3f）。图3.凋落物返田次数(S0、S1、S2和S3)对AOA-amoA(a)、AOB-amoA(b)、AOA-amoA_AOB-amoA(c)、nirS(d)、nirK(e)和nosZ(f)基因拷贝在EI和EF返田土壤中的影响。我们检测到11个AOB-amoA功能基因属，在不同的凋落物返田次数下，在EF返田土壤和EI返田土壤中都有发现（S1和S3）。Norank_p__environmental_samples(37.2%),亚硝化螺菌属(28.0%)和unclassified_k__norank_d__Bacteria(23.8%)是EF和EI返田土壤中AOB-amoA功能基因的优势群体(图4a)。PCoA和ANOSIM分析结果显示，EF和EI返田土壤之间AOB-amoA功能基因的群落组成没有显著差异，但PERMANOVA分析结果显示EF和EI返田土壤之间AOB-amoA功能基因的群落组成略有显著差异（图5a和表2）。在属水平上，在S1和S3下，EI返田土壤中AOB-amoA功能基因群落中unclassified_o__Nitrosomonadales的相对丰度明显高于EF返田土壤（图4a）。在门水平上，如Kruskal-Wallis秩和检验所示，与EF返田土壤相比，EI返田土壤中AOB-amoA功能基因群落中的变形杆菌门的相对丰度显著降低（图6a）。从EF和EI返田土壤中共检测到个nirK功能基因属。我们在S1-EI、S1-EF、S3-EI和S3-EF土壤中分别发现了、、和90个nirK功能基因属。4种土壤有51个相同的nirK功能基因属。在不同的凋落物返田次数下，EI返田土壤中nirK功能基因属的数量明显高于EF返田土壤中的数量（S1）。PCoA和PERMANOVA结果表明，在S1和S3条件下，EI和EF返田土壤之间nirK功能基因的群落存在显著差异(图5b和表2)。在S3时间点，EI返田土壤中假单胞菌属的相对丰度明显低于EF返田土壤。在S1和S3时间点，EI返田土壤中nirK功能基因群落中纤维菌属的相对丰度明显低于EF返田土壤（图4b），但甲基杆菌属,亚硝酸菌属和出芽菌属的相对丰度显著高于EF返田土壤。EI返田土壤中nirK功能基因群落中地嗜皮菌属和中华根瘤菌的相对丰度在S1时显著提高（图4b）。在门水平上，EI返田土壤中nirK功能基因群落中的浮霉菌门相对丰度显著高于EF返田土壤（Kruskal-Wallis秩和检验总结）（图6b）。我们从EI和EF返田的土壤中检测到27个nosZ功能基因属。植物是否被内生真菌侵染和凋落物返田次数对nosZ功能基因属数量有显著影响。Unclassified_p_Proteobacteria(60.8%)和Unclassified_c_Alphaproteobacteria(29.2%)在nosZ功能基因的群落中占主导地位(图4c)。PCoA和ANOSIM结果表明，在不同的凋落物返田次数下（S1和S3），nosZ功能基因的群落组成有显著差异（图5c和表2），EI和EF返田土壤的nosZ功能基因群落中Unclassified_p_Proteobacteria、Unclassified_c_Alphaproteobacteria和Unclassified_c_Rhizobiales的相对丰度没有变化(图4c)，通过Kruskal-Wallis秩和检验，nosZ功能基因的相对丰度没有显著差异（图6c）。图4.凋落物返田，在EI和EF土壤中发现AOB-amoA（a）、nirK（b）和nosZ（c）功能基因的相对丰度。图5.凋落物返田条件下EI和EF土壤中AOB-amoA（a）、nirK（b）和nosZ（c）功能基因的主坐标分析（PCoA）。图6.凋落物返田条件下，在EI和EF土壤中，对AOB-amoA（a）、nirK（b）和nosZ（c）功能基因群落的不同丰度的物种(门水平)进行Kruskal-WallisH检验。表2.相似性分析（ANOSIM）和常数多变量单因子方差分析（PERMANOVA），通过扩增子测序，分析在凋落物返田次数（S）和内生真菌是否侵染植物（E）情况下，AOB-amoA、nirK和nosZ功能基因的群落组成差异。4AOB-amoA、nirK和nosZ功能基因的群落多样性如Chao1指数总结，AOB-amoA，nirK和nosZ功能基因的群落丰富程度分别不受宿主植物是否被内生真菌侵染，凋落物返田次数以及它们之间的相互作用的显著影响（图7a，b和c）。宿主植物状态和凋落物返田次数对AOB-amoA、nirK和nosZ功能基因的群落多样性有显著影响(图7d、e和f)。不同凋落物添加时间（S1）下，EI还田土壤中nosZ功能基因的群落多样性显著低于EF还田土壤（图7f），并且S3下EI还田土壤中nirK功能基因的多样性显著低于EF还田土壤（图7e）。凋落物返田次数对AOB-amoA功能基因的OTU数有显著影响（图7g），而凋落物返田次数和宿主植物是否被内生真菌侵染状态对nirK功能基因的OTU数有显著影响（图7h）。然而，凋落物返田次数和宿主植物是否被内生真菌侵染对nosZ功能基因的OTU数没有显著影响(S1和S3)(图7i)。图7.两种水平的凋落物添加次数（S1和S3）对EI和EF土壤凋落物返田条件下的AOB-amoA基因（a、d和g）、nirK基因（b、e和h）和nosZ（c、f和i）的Chao1、Shannon指数和OUTs数的影响。5AOB-amoA、nirK和nosZ功能基因与土壤性质的关系Spearman相关分析表明，EI和EF返田土壤中AOB-amoA功能基因的绝对丰度和多样性与土壤OC、TN、TP、AN、MBC和MBN呈显著正相关关系（表3）。Unclassified_c_Betaproteobateria与AOB-amoA基因拷贝数、土壤TN、AN、MBN和MBC呈显著负相关，与AOA-amoA和AOB-amoA基因拷贝数比值呈显著正相关（图8a）。EI和EF返田土壤中nirK功能基因的多样性与土壤OC、TN、AN、NN、MBC和MBN呈显著负相关，与C-P比值呈显著正相关，但nirK功能基因的绝对丰度与土壤性质无关（表3）。根瘤杆菌与土壤OC呈显著负相关，与土壤pH呈显著正相关（图8b）。土壤TP、NN和MBN与亚硝酸菌属,硫网菌属，白蚁菌属和Methylocella呈显著负相关，与壳聚糖酶产生菌、中华根瘤菌、Sphingopyxis、和Geodermatophius呈显著正相关（图8b）。土壤OC、TN和MBC与贪铜菌属、白蚁菌属和根瘤菌属呈显著负相关，与Sphingopyxis和中华根瘤菌呈显著正相关（图8b）。C-P的比例与硫网菌属，阿菲波菌属，中慢生根瘤菌属，Methylocella和Isoptericol呈显著正相关，而与壳聚糖酶产生菌，陶厄氏菌属，Geodematophilus和Rhodococcus_f_Nocardiaceae呈显著负相关（图8b）。nirK基因拷贝与纤维菌属和拟诺卡氏菌呈显著正相关，与出芽菌属呈显著负相关（图8b）。C-N的比例与Marmoricola和磁螺菌属有显著的负相关关系（图8b）。EI和EF返田土壤中nosZ功能基因的绝对丰度与土壤pH值和OC呈显著正相关，与SM和C-P比值显著负相关，而Spearman结果显示nosZ功能基因的多样性和丰富度与土壤性质无显著相关性（表3）。土壤TP、AN、NN、MBC和MBN与红长命菌、申氏菌、Unclassified_c__Betaproteobacteria和Unclassified_o__Burkholderiales呈显著正相关。土壤OC和TN也与Rubrivivivax和Unclassified_c__Betaproteobacteria呈显著正相关。土壤TN与Unclassified_o__Burkholderiales呈显著正相关（图8c）。无色杆菌属与nosZ基因拷贝、土壤MBN、TP和NN呈显著正相关，与土壤SM呈显著负相关（图8c）。Spearman相关热图显示，食酸菌属与土壤AN、MBC、MBN有显著的正相关关系，与土壤pH值有显著的负相关关系（图8c）。表3.环境因素与AOB-amoA、nirK和nosZ功能基因群落的Spearman相关性。环境因素包括SM（土壤水分），pH，OC（有机碳），TN（总氮），TP（总磷），C-N，C-P和N-P（OC，TN和TP相互之间的比值），AN（氨态氮），NN（硝态氮），MBC（微生物生物量碳）和MBN（微生物生物量氮），*表示P0.05，**表示P0.01。图8.使用Spearman相关热图直观显示样品中不同物种（属水平）与环境因素之间的关系以及AOB-amoA（a），nirK（b）和nosZ（c）功能基因的丰度。方差膨胀系数(VIF)分析结果表明，土壤SM、pH、OC、TP、AN、MBN和C-N的比值之间的关联性较小(表4)。AOB-amoA功能基因丰度中的RDA排序双曲线表明，随着凋落物的返田，土壤性质的变化分别解释了第一轴和第二轴约36.02％和9.03％的变化（图9a）。AOB-amoA功能基因的相对丰度主要与土壤SM和TP有关，土壤pH值与AOB-amoA功能基因群落中变形菌门的相对丰度呈密切的正相关。AOB-amoA功能基因的绝对丰度与土壤TP，OC，AN和MBN呈正相关（图9a）。此外，nirK功能基因与土壤性质之间的RDA第一轴和第二轴分别解释了60.90%和25.31%的变化（图9b）。土壤MBN、OC、TP和AN影响nirK功能基因的绝对丰度和相对丰度，土壤TP与nirK功能基因中Actinobacteria_d__Bacteria的相对丰度密切正相关（图9b）。对于nosZ功能基因群落，RDA的第一轴和第二轴分别可以解释44.63％和18.13％的方差，并且nosZ功能基因的绝对和相对丰度主要与土壤TP，OC，AN和MBN相关（图9c）。表4.用方差膨胀系数（VIF）分析群落分布与环境因素之间的共同关系。图9.对EI和EF凋落物返田土壤中AOB-amoA（a），nirK（b）和nosZ（c）功能基因的绝对和相对丰度的冗余分析。

讨论

虽然有公开的资料表明Epichlo?内生真菌对凋落物分解的影响，但很少有详细的数据表明带有Epichlo?内生真菌的凋落物如何影响土壤微生物环境以及土壤功能基因的丰富性和多样性。利用实时荧光定量PCR和扩增子测序的方法我们调查了土壤微生物环境和功能微生物群对内生真菌E.festucaevar.lolii侵染的凋落物返田的响应。我们发现，与无Epichlo?凋落物返田相比，Epichlo?感染的植物凋落物返田通过增加土壤OC、TN、TPAN和NN以及MBC和MBN，降低土壤pH值来改变土壤微生物环境。此外，Epichlo?侵染的凋落物返田在S1和S3时间增加了AOB-amoA功能基因的绝对丰度，在门类水平上增加了nirK功能基因群落中甲基杆菌属、亚硝酸菌属、出芽菌属、地嗜皮菌属、中华根瘤菌和浮霉菌的相对丰度。但是，Epichlo?感染的植物凋落物降低了nirK功能基因在S1和S3时的绝对丰度以及S3时的多样性，降低了nosZ功能基因在S1、S2和S3时的绝对丰度以及S1的多样性，降低了AOB-amoA功能基因群落中变形菌在门类水平上的相对丰度。AOB-amoA、nirK和nosZ功能基因的群落多样性与土壤TP、OC、AN和MBN呈密切正相关关系。1含内生真菌的凋落物返田影响土壤性质在凋落物分解过程中，凋落物中三分之二的碳以可溶性碳或残渣的形式进入土壤，当微生物的营养需求不受磷供应的限制时，凋落物中的磷被释放到土壤中。凋落物本身的化学性质对凋落物的分解速率影响很大，凋落物的养分释放速率和能量释放潜力也与凋落物的质量有关。Epichlo?内生真菌的侵染促进了寄主植物的生长和分蘖的产生，因此在生长季结束时可能积累了大量的生物量；与没有内生真菌的叶片相比，具有Epichlo?内生真菌的衰老叶片的化学成分（例如内生生物碱）可能不同；此外，Epichlo?内生真菌的菌丝体含有一些氮和磷成分。一些研究探讨了Epichlo?内生真菌在凋落物分解过程中的作用，以及通过影响凋落物质量间接影响土壤性质。我们发现，EI凋落物中的植物OC、TN和TP含量均高于EF凋落物，而且含内生真菌E.festucaevar.lollii的凋落物增加了土壤SOC、TN、TP、AN和NN的含量，降低了土壤pH值。周勇等人（内生真菌感染对禾草宿主生境土壤特性和微生物群落的影响.植物生态学报.）还发现，羊草内生真菌Epichlo?bromicola在凋落物分解的前三天显著增加了土壤N含量、C矿化和初始C矿化速率。Khayamim等人（EffectofNeotyphodiumendophyte-tallfescuesymbiosisonmineralogicalchangesinclay-sizedphlogopiteandmuscovite.PlantandSoil.）发现，由于外源氮的输入可以降低土壤pH值，Epichlo?内生真菌侵染的植物根际土壤pH值显著降低。Epichlo?内生真菌通过改变凋落物质量对土壤性质有重要影响。2含Epichlo?内生真菌的凋落物返田影响微生物生物量

微生物生物量是土壤活性成分之一，可用于表征土壤有机资源生化有效性。秸秆还田土壤微生物生物量C和N的增加幅度大于未还田土壤。我们发现，与EF还田土壤相比，EI还田土壤的微生物生物量C和N显著增加。然而，这些发现与北卡罗来纳州立大学的Franzluebbers和Hill（Soilcarbon,nitrogen,andergotalkaloidswithshort-andlong-termexposuretoendophyte-infectedandendophyte-freetallfescue.SoilScienceSocietyofAmericaJournal,）报道的结果并不一致，他们在32天的分解实验中发现高羊茅的EI叶对微生物生物量C略有抑制，但净微生物生物量N却被真菌内生菌Epichlo?coenophiala增强。两种结果差异的一个原因可能是由于凋落物质量、寄主植物和内生真菌的不同，另一个原因可能与实验处理有关。

3含Epichlo?内生真菌的植物凋落物影响AOB-amoA、nirK和nosZ功能基因的丰度和多样性自然界中氨的可用性被认为是AOA-amoA和AOB-amoA功能基因的群落结构中的关键因素。AOA-amoA和AOB-amoA功能基因在土壤中的氨氧化过程中都发挥了重要作用。Epichlo?内生真菌对土壤细菌群落丰度和结构的影响在不同类型的禾草内生真菌共生体间存在差异，而且内生真菌的侵染可以通过改变凋落物的质量和分解者群落（如细菌、真菌和土壤无脊椎动物）来改变凋落物的分解。我们的研究结果还表明，Epichlo?内生真菌感染可以改变凋落物的质量，在S1和S3时期，含有内生真菌E.festucaevar.lollii的凋落物显著增加了AOBamoA功能基因的绝对丰度，但内生真菌对AOA-amoA功能基因的绝对丰度无显著影响。同样地，Yang等人（FungalendophytePhomopsisliquidambariaffectsnitrogentransformationprocessesandrelatedmicroorganismsinthericerhizosphere.FrontiersinMicrobiology.）的研究表明，EI处理S1期（分蘖期）的AOA-amoA基因和S1和S2期（分蘖期和灌浆期）的AOB-amoA基因的绝对丰度分别高于EF处理。AOA-amoA和AOB-amoA功能基因相对贡献的差异可能与土壤类型、温度、施氮量、降水和共生微生物等因素有关。这两种反硝化酶（Nir和N2OR）位于细胞质膜外，对环境胁迫十分敏感。nirK和nirS和nosZ功能基因已被用作土壤中种群的标记。研究发现，内生真菌高羊茅变种（E.festucaevar.lollii）显著增加了nirK和nirS功能基因在S1和S3时的绝对丰度，且随着凋落物返田次数的增加，nirS和nirK功能基因的绝对丰度显著增加。这些发现与以前的研究结果一致，表明添加生物炭增加了微生物氮循环基因的丰度。在我们的研究结果中，内生真菌E.festucaevar.lollii显著降低了S1到S3中nosZ功能基因的绝对丰度。此外，内生真菌E.festucaevar.lollii显著降低了S3中nirK功能基因和S1中nosZ功能基因的多样性。可能的解释是内生真菌E.festucaevar.lollii抑制nirK和nosZ功能基因中的微生物。在海洋和农业生态系统中，变形菌门细菌的功能是多种多样的。在S1和S3时间点，EI返田土壤中AOB-amoA功能基因群落中变形菌门细菌的相对丰度显著低于EF返田土壤。这一结果与Jenkins等人（Assessingshort-termresponsesofprokaryotic

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